Microbiología/Exámen microscópico de Bacterias

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EXAMEN MICROSCÓPICO DE BACTERIAS

I. EXAMEN MICROSCÓPICO

El examen microscópico de las bacterias se puede realizar de 2 maneras:

     1.1 En fresco
     1.2 En preparaciones fijadas y teñidas

1.1. En fresco:

Este examen se emplea para el estudio de algunas características de los microorganismos, como por ejemplo movilidad, aglutinación, yemación, entre otras, es decir se realiza una observación de los microorganismos vivos. Cuando se observa al microscopio un líquido orgánico, como sangre, líquido céfalo-raquídeo, orina, pus, etc., se puede también estudiar elementos citológicos como leucocitos y la presencia o no de bacterias en ellos, glóbulos de pus, parásitos, etc.

Técnica:

a) Si la muestra es líquida, colocar una gota del material patológico en un portaobjetos b) Si la muestra es sólida, hacer una suspensión en suero fisiológico y colocar una gota sobre un portaobjetos c) Si se desea hacer una observación en fresco a partir de una colonia aislada, colocar una gota de suero fisiológico en un portaobjetos y luego con el asa de cultivo tomar una porción de la colonia y hacer una suspensión d) En todos los casos, cubrir la preparación con un cubreobjetos e) Cuando se sospecha que existen pocas bacterias en la muestra, se debe dejar sedimentar o centrifugar f) Cuando la muestra es muy espesa (pus, expectoración), suspender en suero fisiológico y agitar g) Una vez lista la preparación, observar en microscopio con el condensador abajo, utilizando el objetivo seco de mayor aumento 1.2. En preparaciones fijadas y teñidas

Las bacterias vivas son casi incoloras y no tienen suficiente contraste con el medio que las rodea, lo cual hace su observación dificultosa. Al teñirlas se les otorga un contraste de color respecto al medio que las rodea, ya que el colorante reacciona con la célula pero no con el medio externo, con lo cual se hacen más visibles.

Las ventajas principales de la tinción son: - Proporciona un contraste que permite una mejor observación de las bacterias - Permite el estudio en detalle de la morfología de las bacterias - Permite el estudio de las estructuras internas y externas de las bacterias (flagelos, esporas, núcleo, cápsula, pared celular, etc) - Permite lograr un aumento mayor (lente de inmersión)

Antes de teñir las bacterias, se realiza primero una extensión del material a examinar y posteriormente la fijación del material al portaobjetos.


A) Extensión a) Los portaobjetos deben estar absolutamente limpios y desgrasados, para lo cuál es conveniente mantenerlos sumergidos en una mezcla de alcohol - acetona b) Secar prolijamente un portaobjetos c) Colocar en el centro una gota del material a examinar, si este es líquido d) Si se trata de una colonia cultivada en un medio sólido, colocar en el centro del portaobjetos una gota de suero fisiológico y luego con el asa de cultivo tomar una porción de la colonia y hacer una suspensión e) Extender la muestra con el asa, en una capa delgada y uniforme, sin llegar hasta los bordes del portaobjetos.

B) Fijación a) La fijación tiene por objetivo matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la célula y adherir firmemente las bacterias al portaobjetos, evitando así que se desprenda durante los lavados posteriores b) El calor es un buen agente fijador ya que preserva las estructuras de la bacteria, en su forma y posición, sin producir mayores alteraciones c) Pasar rápidamente la preparación sobre una llama suave, 2 ó 3 veces d) Dejar que la preparación se enfríe y volver a pasar por la llama e) Repetir hasta que la preparación quede completamente seca f) Posterior a cada paso por el mechero, tocar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano contraria, para calcular la intensidad del calor aplicado g) No debe calentarse jamás hasta quemar la piel h) También se puede fijar la muestra dejándola secar al aire o mediante fijadores químicos como alcohol etílico o alcohol – acetona

C) Coloración Los colorantes empleados en bacteriología son colorantes sintéticos. En la práctica los colorantes se dividen en 2 grupos: ácidos y básicos.

Los colorantes Básicos están formados por un catión coloreado y un anión incoloro, mientras que en los colorantes Acidos es todo lo contrario. Las células bacterianas son ricas en ácidos nucleicos que tienen cargas negativas en forma de fosfatos. Estas cargas se combinan con los colorantes básicos cargados positivamente, por lo cual la bacteria se tiñe uniformemente, ya que existen ácidos nucleicos tanto en el núcleo (ADN), como en el citoplasma (ARN). Los colorantes ácidos tienen mayor afinidad a combinarse con el citoplasma de las células de organismos superiores.

En bacteriología se usan casi exclusivamente los colorantes básicos (Cristal Violeta, Fucsina, Safranina, Azul de Metileno, etc).


Existen 2 métodos de coloración principales:

1) Coloración Simple 2) Coloración Doble

1) Coloración Simple: consiste en hacer actuar sobre la preparación fijada un solo colorante (Azul de Metileno, Safranina, Fucsina diluída al 10%, etc).

Técnica

a) Cubrir la preparación con el colorante b) Dejar actuar por 1 - 2 minutos c) Lavar con agua corriente d) Secar con papel absorbente y luego a la llama suave ( sin quemar ) e) Observar con el condensador arriba y con objetivo de inmersión


2) Coloración Doble: consiste en hacer actuar 2 colorantes diferentes, con una decoloración intermedia, sobre una preparación fijada. La coloración doble consta en general de 4 pasos: - Coloración primaria - Adición de un mordiente, que es una sustancia que aumenta la afinidad o atracción célula – colorante. La bacteria se tiñe más intensamente bajo la acción del mordiente, siendo mucho más difícil lavar el colorante posteriormente. Ejemplos de mordientes son algunos ácidos, bases, sales metálicas y solución yodo-yodurado - Decoloración - Tinción con colorante de contraste


2.1. Tinción de Gram: es la coloración más empleada en bacteriología por su gran utilidad en la clasificación de las bacterias. Descubierta por Christian Gram (1884), mientras desarrollaba una tinción para bacterias en tejidos, descubrió un método de tinción diferencial para las bacterias. Esta tinción es de gran utilidad ya que permite una clasificación taxonómica de las bacterias, en Gram positivas y negativas, que se relaciona además con otras propiedades morfológicas (Figura 11).

Técnica a) Teñir la preparación ya fijada con Cristal Violeta durante 2 minutos b) Eliminar el exceso de colorante y cubrir con Lugol durante 1 minuto (mordiente) c) Decolorar rápidamente con Alcohol Acetona d) Lavar con agua corriente (en este momento las bacterias Gram positivas están teñidas de color violeta y las Gram negativas están decoloradas) e) Teñir con Fucsina fenicada durante 30 segundos f) Lavar con agua corriente g) Secar con papel absorbente y luego a la llama suave ( sin quemar ) h) Observar con el condensador arriba y con objetivo de inmersión i) Las bacterias Gram positivas se tiñen de color Violeta y las Gram negativas de color Rojo.

Figura 11. Diferencias entre bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas. http://e-ducativa.catedu.es/44700165/aula/archivos/repositorio/3250/3408/html/22_pared_bacteriana.html

2.2 Tinción de ZielhNeelsen: se emplea para diferenciar bacterias ácido-alcohol resistentes (principalmente el Mycobacterium de la tuberculosis), de los que no lo son. Las bacterias Acido Alcohol resistentes tienen en la pared celular una gran cantidad de Acido Micólico el cual esta unido covalentemente a un fosfolípido (Arabino galactano), el cual forma un complejo estable con la Fucsina, de carácter altamente hidrofóbico que impide la penetración del decolorante.

Técnica

a) Teñir la preparación ya fijada con Fucsina concentrada de Zielh Neelsen durante 3 a 5 minutos, calentando la preparación suavemente con la llama del mechero, hasta la emisión de vapores ( La preparación de no se debe secar y el colorante no debe hervir) b) Decolorar rápidamente con Acido-Alcohol hasta que se desprenda el colorante (en este momento las bacterias ácido-alcohol resistentes están teñidas de color rojo y las no resistentes están decoloradas) c) Lavar con agua corriente d) Teñir con Azul de Metileno durante 2 minutos e) Lavar con agua corriente f) Secar con papel absorbente y luego a la llama suave ( sin quemar ) g) Observar con el condensador arriba y con objetivo de inmersión h) Las bacterias ácido-alcohol resistentes se tiñen de color Rojo y las no resistentes de color Azul


TINCIONES DE ESTRUCTURAS BACTERIANAS

1. Tinción de Flagelos: Los flagelos son una estructura demasiado fina para ser observadas por los métodos corrientes de tinción. En general todos los métodos se basan en el empleo del Acido Tánico, cuyas sales forman un precipitado grueso sobre la pared celular y los flagelos. De esta forma el diámetro de los flagelos aumenta artificialmente y es posible observarlas después de teñirlos con Fucsina Básica. Debe emplearse cultivos jóvenes de no más de 15 a 20 horas y la extensión debe hacerse suavemente para no romper los flagelos.

Ejemplos de tinción para diferentes estructuras bacterianas: - FLAGELOS: Tinción de Casares – Gil, los flagelos se observan de color rojo al igual que las bacterias. - CAPSULA: Tinción de Olt, la cápsula se observa de color anaranjado y las bacterias de color rojo (específica para Bacillus anthracis). - ESPORAS: Tinción de Schaffer y Fulton, las esporas se tiñen de color verde y la parte vegetativa de color rojo.