Microbiología/Antibiograma
ANTIBIOGRAMA
La tendencia cada vez mayor de muchas bacterias a hacerse resistentes a los antibióticos, parece indicar que el uso inadecuado de los antimicrobianos puede conducir a graves consecuencias, de ahí la importancia de elegir el antibiótico adecuado para una determinada bacteria, con la ayuda de pruebas de susceptibilidad in vitro o antibiograma. Sin embargo la elección del antibiótico más apropiado también dependerá de las concentraciones efectivas que pueda alcanzar el antibiótico in vivo, que depende de la biodisponibilidad de la droga.
Para comprender la importancia del antibiograma, se requiere saber lo que es el espectro antimicrobiano y la resistencia de las bacterias frente a un antibiótico
- Espectro antimicrobiano: Es la capacidad que tiene un antibiótico de actuar sobre un determinado número o clase de especies bacterianas
- Resistencia: Es la capacidad que poseen ciertas bacterias de crecer y multiplicarse en presencia de un antibiótico
De estas 2 definiciones se deduce que antes de hacer un tratamiento con un antibiótico, es necesario hacer un estudio “in vitro” de la sensibilidad o susceptibilidad del microorganismo causantes de la enfermedad frente a diversos antibióticos que podrían utilizarse.
Existen varios métodos para realizar antibiogramas, los que pueden clasificarse en 2 grupos:
1. Método de dilución en serie del antibiótico
2. Método de difusión del antibiótico en agar
1. METODO DE DIFUSION EN AGAR (METODO DEL DISCO)
Este es el método más empleado por ser rápido, sencillo y muy reproducible. Se utiliza desde la década de los 40 y fue estandarizado en 1966 por Kirby Bauer. Actualmente se utiliza una modificación de la técnica de Kirby Bauer la cual ha sido estandarizada por el NCCLS (National Committe for Clinical Laboratory Standars)
Esta prueba mide la capacidad de un antibiótico (discos de papel impregnados con cantidades conocidas de antibióticos en UI o ug) de difundir a través de un agar, para inhibir el crecimiento de las bacterias. La magnitud de la zona de inhibición no es una función de la actividad in vivo del medicamento. Las magnitudes de los halos no son comparables entre diferentes antibióticos.
La prueba del disco es un test cualitativo, es decir, mide solamente la inhibición del crecimiento y por lo tanto no indica necesariamente actividad bactericida. Sin embargo existe una correlación directa entre los diámetros de inhibición y los CMI obtenidas por la prueba de dilución en tubo.
1. Medios de cultivos recomendados
a) Se recomienda el uso de agar Muller Hinton, pH 7.2 – 7.4 b) En caso de realizar la prueba con bacterias de difícil desarrollo, se utiliza Agar sangre o agar Muller Hinton adicionado de 5% de sangre desfibrinada de cordero c) Las placas preparadas (con una altura del agar de 4 mm y completamente nivelado) se dejan a temperatura ambiente, el tiempo suficiente para que se evapore la humedad de la superficie. También se pueden colocar en la estufa a 37°C por 30 minutos.
2. Preparación del inoculo
a) Empleando un asa de cultivo recoger 4 a 5 colonias desde un cultivo completamente puro y aislado de la cepa a investigar b) Transferir las colonias a 5 mL de Caldo Muller Hinton, Caldo Nutritivo o Caldo Tripticasa Soya y realizar una emulsión c) Comparar la turbidez de la emulsión con el estándar de turbidez ( Mc Farland 0,5, que equivale a una concentración de 108 bacterias/mL) d) Si la emulsión queda más turbio que es estándar, se debe diluir con el mismo caldo utilizado e) Si la emulsión tiene menor turbidez, se debe agregar mayor cantidad de colonias
3. Inoculación de las placas
a) Introducir una tórula de algodón estéril en el caldo ajustado b) Elevar la tórula sobre la superficie del caldo y presionarla contra las paredes interiores del tubo para eliminar el exceso de inoculo c) Frotar la superficie del agar con la tórula en forma densa, en 3 direcciones ( horizontal, vertical y diagonal ) y cubriendo toda la superficie de la placa d) Dejar secar la placa por 5 – 10 minutos e) Elegir los antibióticos a utilizar de acuerdo a la identificación de la cepa f) Colocar los discos de sensibilidad con pinza esterilizada a la llama y previamente enfriada g) Presionar suavemente los discos para asegurar su implantación a la superficie del agar h) Colocar los discos suficientemente separados. No más de 6 a 8 por placa i) Una vez colocado un disco, nunca se debe mover, ya que el antibiótico comienza a difundir casi instantáneamente j) Incubar la placa a 37°C por 18 – 24 horas
Los discos a utilizar para el antibiograma tienen diferentes presentaciones: Sensidíscos, Multidiscos y Dispensador simultáneo de discos.
4. Medición de los halos
a) Las zonas de inhibición ( diámetro ) se miden con una regla y se expresa en milímetros (incluyendo los 0.7 cm de diámetro del disco) b) La lectura se realiza contra un fondo oscuro con luz reflejada c) Las zonas se miden por la parte posterior de la placa sin abrirla d) Si se emplea agar sangre debe abrirse la placa y medir desde arriba e) El punto límite para medir el halo es la inhibición completa de desarrollo observado a ojo desnudo, excepto para Sulfonamidas y si se trata de especies Proteus f) Con las Sulfonamidas, puede observarse un desarrollo tenue ( 80% de inhibición ) dentro del halo, debido a que las bacterias alcanzan a multiplicarse algunas generaciones antes que el antibiótico actúe sobre éllas g) Las cepas de Proteus presentan un pequeño velo de desarrollo dentro de la zona de inhibición que no debe ser considerado h) El diámetro de los halos se compara con una tabla estandarizada que fija los límites entre sensibilidad, sensibilidad intermedia y resistencia.
2. METODO DE DILUCION EN SERIE
Es un método cuantitativo que se realiza en medios líquidos. El antibiótico en estudio se distribuye en concentraciones progresivamente decrecientes en una serie de tubos con un medio apropiado, sembrándose después en este medio cantidades idénticas del cultivo de 18 horas de incubación de la bacteria cuya sensibilidad se quiera estudiar.
Se incuban los tubos a 37°C por 24 horas y se busca el último tubo en que hay ausencia de desarrollo. La concentración del antibiótico de este tubo nos indica el título de sensibilidad o Concentración Mínima Inhibitoria del antibiótico (CMI), siendo expresada en ug/mL. La CMI es la concentración más baja del agente antimicrobiano a la cual el microorganismo no es capaz de desarrollarse, pero que al ser inoculado en un caldo libre del agente se desarrolla normalmente. Esta determinación permite establecer con exactitud una relación con los niveles alcanzados por la droga en la sangre y así elegir el antibiótico adecuado. Por ejemplo si una bacteria presenta una CMI de 100 ug/mL y el antibiótico no es capaz de alcanzar estos niveles sanguíneos, no tendrá efecto sobre la bacteria.
También se puede calcular la Concentración Mínima Bactericida (CMB) que es la concentración más baja del agente antimicrobiano a la cual el microorganismo no es capaz de desarrollarse y que al ser inoculado en un caldo libre del agente tampoco se desarrolla.
Este es un método caro, lento y engorroso, pero con un mayor rango de seguridad que el método del disco.