Histología/Microscopía

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El microscopio (de micro-, pequeño, y scopio, σκοπεω, observar) es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El tipo más común y el primero que se inventó es el microscopio óptico. Se trata de un instrumento óptico que contiene dos o más lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción.

El microscopio[editar]

Microscopio compuesto fabricado hacia 1751 por Magny. Proviene del laboratorio del duque de Chaulnes y pertenece al Museo de Artes y Oficios, París.
  • Entre 1590 y 1600, el óptico holandés Zacharías Janssen (1580-1638) inventó un microscopio con una especie de tubo con lentes en sus extremos, de 8 cm de largo soportado por tres delfines de bronce; pero se obtenían imágenes borrosas a causa de las lentes de mala calidad. Estos primeros microscopios aumentaban la imagen 200 veces.
  • En 1665 Robert Hooke observó con un microscopio un delgado corte de corcho y notó que el material era poroso, en su conjunto, formaban cavidades poco profundas a modo de celditas a las que llamó células. Se trataba de la primera observación de células muertas. Unos años más tarde, Marcello Malpighi, anatomista y biólogo italiano, observó células vivas. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio.
  • A mediados del siglo XVII un holandés, Anton van Leeuwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricación propia, describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos. El microscopista Leeuwenhoek, sin ninguna preparación científica, puede considerarse el fundador de la bacteriología. Él tallaba sus lupas, sobre pequeñas esferas de cristal, cuyos diámetros no alcanzaban el milímetro (su campo de visión era muy limitado, de décimas de milímetro). Con estas pequeñas distancias focales alcanzaba los 275 aumentos.
  • Durante el siglo XVIII continuó el progreso y se lograron objetivos acromáticos por asociación de Chris Neros y Flint Crown obtenidos en 1740 por H. M. Hall y mejorados por John Dollond. De esta época son los estudios efectuados por Isaac Newton y Leonhard Euler. En el siglo XIX, al descubrirse que la dispersión y la refracción se podían modificar con combinaciones adecuadas de dos o más medios ópticos, se lanzan al mercado objetivos acromáticos excelentes.
  • Durante el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos mecánicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso, aunque no se desarrollaron por el momento mejoras ópticas. Las mejoras más importantes de la óptica surgieron en 1877, cuando Ernst Abbe publicó su teoría del microscopio y, por encargo de Carl Zeiss, mejoró la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos de 2000. A principios de los años 1930 se había alcanzado el límite teórico para los microscopios ópticos, no consiguiendo estos aumentos superiores a 500X o 1,000X.
  • El microscopio electrónico de transmisión (TEM) fue el primer tipo de microscopio electrónico desarrollado. Utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de 100.000X. Fue desarrollado por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido.

Cronología del desarrollo del microscopio[editar]

  • 1590: Fue en 1590 los fabricantes holandeses de anteojos, Hans Janssen y su hijo Zacharias Janssen inventaron un microscopio compuesto.
  • 1609: Galileo Galilei desarrolla un occhiolino o microscopio compuesto de una lente convexa y una cóncava.
  • 1612: Galileo presenta el occhiolino al rey de Polonia Segismundo III.
  • 1619: Cornelius Drebbel (1572 - 1633) presenta en Londres, un microscopio compuesto de dos lentes convexas.
  • 1622: Drebbel presenta su invento en Roma.
  • 1624: Galileo presenta su occhiolino al Príncipe Federico Cesi, fundador de la Academia de los Linces).
  • 1625: Giovanni Faber de Bamberg (1574 - 1629), miembro de la Academia de los Linces, acuña la palabra microscopio por analogía con telescopio.
  • 1665: Robert Hooke publica Micrographia, una colección de micrografías biológicas. Acuña la palabra célula para las estructuras que descubre en una corteza de corcho.
  • 1674: Anton van Leeuwenhoek inventa el microscopio simple.
  • 1931: Ernst Ruska y Max Knoll construyen el primer microscopio electrónico.
  • 1965: Manfred von Ardenne desarrolla el primer microscopio electrónico de barrido.
  • 1981: Gerd Binnig y Heinrich Rohrer desarrollan el microscopio de efecto túnel.
  • 1985 Binnig y Rohrer desarrollan el microscopio de fuerza atómica

Microscopio óptico[editar]

Diagrama simple de la óptica de un microscopio.

El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio óptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general, se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces. El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo está compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios están dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se mira a través del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real, el aumento total del microscopio depende de las distancias focales de los dos sistemas de lentes (Figura 4).

Microscopio óptico. Descripción:
A) ocular,
B) objetivo,
C) portador del objeto,
D) lentes de la iluminación,
E) sujeción del objeto,
F) espejo de la iluminación.

El microscopio óptico tiene un límite resolución (que es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para que puedan visualizarse por separado) de cerca de 200 nm (0.2 µm ), en tanto que el microscopio electrónico puede incrementarlo en aproximadamente 1000 veces (Figura 5).

Figura 5. Tamaños relativos de las células y sus componentes. [1]

El equipamiento adicional de un microscopio consta de un armazón con un soporte para el material examinado y de un mecanismo que permite acercar y alejar el tubo para enfocar la muestra. Los especímenes o muestras que se examinan con un microscopio son transparentes y se observan con una luz que los atraviesa; se suelen colocar sobre un rectángulo fino de vidrio. El soporte tiene un orificio por el que pasa la luz. Bajo el soporte se encuentra un espejo que refleja la luz para que atraviese el espécimen. El microscopio puede contar con una fuente de luz eléctrica que dirige la luz a través de la muestra (Figura 6).

Microscopio de contraste de fase[editar]

El microscopio de contraste de fases fue creado por Frits Zernike en 1932. Este microscopio permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen (Figura 7).

Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.

Construcción simplificada de un microscopio de contraste de fase. Las diferencias de fase entre la luz que pasa a través del objeto y el fondo se producen al pasar los rayos a través de las diferentes partes de una placa de fase. Los rayos de luz se superponen en el plano de la imagen, la producción de contraste es debido a su interferencia.

Microscopio confocal[editar]

Principios en los que se basa la microscopía confocal

El microscopio confocal, es un microscopio óptico que incorpora dos diafragmas; uno de iluminación localizado tras la fuente luminosa denominado Pinhole de Excitación, cuya utilidad es eliminar la luz proveniente de planos superiores e inferiores al plano focal, aumentando con ello la claridad y resolución de la imagen; y otro de detección, de tamaño variable situado delante del fotodetector, denominado Pinhole de Emisión. El microscopio confocal incrementa el contraste y/o reconstruir imágenes tridimensionales utilizando un “pinhole” espacial (colimador de orificio delimitante) para eliminar la luz desenfocada o destellos de la lente en especímenes que son más gruesos que el plano focal (Figura 8).

La propiedad fundamental y distintiva de la imagen confocal es que solo lo que está enfocado es detectado. Las áreas de la muestra fuera de foco aparecen negras, y no contribuyen a la formación de la imagen. Puesto que solo se ilumina un punto cada vez en el microscopio confocal, se requiere una exploración (scanning) sobre un raster regular en el espécimen para obtener imágenes bi o tridimensionales. La delgadez del plano focal se define mayormente como el cuadrado de la apertura numérica de la lente del objetivo y también por las propiedades ópticas del espécimen y el índice de refracción del ambiente.


Microscopio de fluorescencia[editar]

Microscopio de Fluorescencia

En el microscopio de fluorescencia los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda (Figura 9). La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Para dejar pasar solo la emisión secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo (Figura 10). Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos.

Estructura de un microscopio de fluorescencia

Microscopio electrónico[editar]

El microscopio electrónico utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar ampliaciones hasta 5000 veces más potentes que los mejores microscopios ópticos, debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles".

Microscopio electrónico de Barrido
Microscopio electrónico de Transmisión

El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930, quienes se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones.

Funcionamiento[editar]

El microscopio electrónico funciona con un haz de electrones generados por un cañón electrónico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnéticas (todo ello al alto vacío ya que los electrones son absorbidos por el aire). Un rayo de electrones atraviesa la muestra (debidamente deshidratada y en algunos casos recubierta de una fina capa metálica para resaltar su textura) y la amplificación se produce por un conjunto de lentes magnéticas que forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de un computador. Los microscopios electrónicos producen imágenes sin ninguna clase de información de color, puesto que este es una propiedad de la luz y no hay una forma posible de reproducir este fenómeno mediante los electrones; sin embargo, es posible colorear las imágenes posteriormente, aplicando técnicas de retoque digital a través del computador.

Tipos[editar]

Comparación de la formación de la imagen en un microscopio de transmisión óptica, un microscopio electrónico de transmisión (TEM), un microscopio electrónico de barrido (SEM) y un tubo de rayos catódicos (CRT) de pantalla de TV.

Existen dos tipos principales de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de transmisión y el microscopio electrónico de barrido (Figura 11). El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto cuya imagen se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar la imagen de un objeto hasta un millón de veces.

En el microscopio electrónico de barrido (MEB) la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie.

En la Figura 12 se muestra una comparación de la formación de la imagen en un microscopio de transmisión óptica, un microscopio electrónico de transmisión (TEM) y un microscopio electrónico de barrido.