Efectores en hongos y oomicetos/Efectores en oomicetos

Los efectores secretados por oomicetos, tanto apoplásticos como citoplasmáticos, son proteínas modulares compuestas por una sección dedicada a la orientación de la proteína y la otra siendo una sección funcional (51) (Figura 1).

Figura 1. (Efectores secretados en Oomicetos). Tipos de efectores según localización

Los efectores apoplásticos tienen péptidos señal en su parte N-terminal para la secreción, seguidos de uno o más módulos funcionales C-terminales. Los efectores citoplasmáticos tienen una región N-terminal utilizada para secreción y translocación dentro de las células del hospedero y una región C-terminal en la que se concentra la actividad bioquímica efectora.

Los efectores citoplasmáticos se caracterizan también por tener motivos conservados en su región N-terminal que siguen al péptido señal. En la región C-terminal de estos efectores se observan a menudo altos niveles de polimorfismo y selección positiva, lo que es consistente con la afirmación que establece que esta región es la que ejecuta la función efectora al interior de la célula, interactuando y coevolucionando con proteínas de resistencia al interior de la célula hospedera (22; 51).

Mecanismos de ingreso del parásito al hospedero

La infección, al menos en el caso de P. infestans, comienza con la propagación de esporangios por medio del viento, los cuales liberan zoosporas en la superficie de la planta. Luego, las zoosporas reconocen tejidos en el hospedero utilizando varios mecanismos, entre ellos el reconocimiento de la carga de la superficie de la planta y el reconocimiento de sustancias químicas específicas, como isoflavonas inespecíficas, como aminoácidos que son exudadas por la planta (22). La concentración de estas sustancias es informativa para el patógeno, pues es un indicador de los sitios óptimos para infección.

También puede observarse un fenómeno llamado auto-agregación, en el cual las zoosporas atraen más zoosporas por quimiotaxis (55), incrementando así la frecuencia de infecciones exitosas (22). La percepción de estas sustancias por parte de las zoosporas hace que estas se enquisten y formen apresorios para ingresar a la planta. En el interior de la planta, partes especializadas se forman para adquirir nutrientes de la planta (haustorios). Cuando estas estructuras penetran las células vegetales permanecen recubiertas por una capa lipídica derivada de la membrana plasmática vegetal, esta capa lipídica (membrana extra-haustorial) será atravesada luego por las proteínas efectoras del parásito para mediar la virulencia y las respuestas hipersensibles de la planta (22).

Ingreso de los efectores a la célula hospedera

El ingreso de los efectores en las células hospederas se da mediante motivos conservados presentes entre el péptido señal y el dominio efector de las proteínas efectoras citoplasmáticas (22).

Esta idea fue sugerida, en principio, dada la similitud que existe entre las proteínas secretadas por oomycetes fitopatógenos y las proteínas señal de varias especies parásitas causantes de la malaria. La similitud entre estas estructuras sugiere una función conservada en la capacidad de oomycetes y parásitos de la malaria para producir enfermedad en el hospedero (47).

Los parásitos causantes de la malaria requieren la presencia de motivos RXLXE/D/Q para translocar sus proteínas efectoras al interior de los eritrocitos de su hospedero (61). Recientemente ha sido demostrado que, al introducir el motivo RXLR en reemplazo del motivo RXLXE en Plasmodium sp., el patosistema de éste organismo funciona normalmente (61).

Efectores en oomycetes hemibiótrofos

Dos formas generales de catalogar las proteínas efectoras es como apoplásticas y citoplasmáticas (21). Las primeras son acumuladas en el espacio intercelular las segundas son transportadas al interior de la célula (8).

Efectores apoplásticos

Estos tipos de efectores que interactúan con estructuras extracelulares y receptores superficiales de la planta están implicados en varias funciones (51). En el caso de Phytophthora infestans se ha encontrado que estos son los efectores mas regulados durante la fase de infección (51).

Enzimas Inhibitorias

Éstas inhiben la acción de ciertas proteínas que posee la planta para protegerse de infecciones. En el caso de Phytophthora, este patógeno ha desarrollado proteínas que inhiben la actividad de glucanasas y proteasas secretadas por la planta (29).

Inhibidores de Glucanasas

Ejemplos de inhibidores de glucanasas son los GIP1 y 2 en P. sojae, patógeno de la soya (49). Estos están encargados de inhibir la degradación en la pared celular de glucanos ß-1,3 y ß-1,6. Al ser degradados por endoglucanasas se libera oligosacáridos que generan una respuesta inmune en la planta (29).

Inhibidores de serín proteasas

Dos proteínas EPI1 y EPI10 se presume que inhiben la actividad de P69, una proteína de tomate que degrada varios proteínas secretadas por P. infestans durante la infección. Estas proteínas inhibitorias forman parte de la familia Kazal (57).

Inhibidores de cisteín proteasas

EPIC1 y EPIC2 son dos inhibidores de cisteín proteasas presentes en P. infestans. Éstas se presumen que están implicadas en la inhibición de proteasas tipo papaína presentes en tomate (29).

Proteínas pequeñas ricas en cisteínas

Son proteínas secretadas de menos de 150 aminoácidos con un número impar de residuos de cisteína y que están relacionadas con avirulencia e inducción de la defensa de la planta (35).

Elicitinas

Estas proteínas inducen muerte celular y otras respuestas de defensa en la planta. Ejemplos de estas son INF1 en P. infestans (30). Estas proteínas son ancladas a la superficie del P. infestans en donde interactúan con las células del hospedero. Se cree que la función de éstas es transportar esteroles (29). En cuanto el desencadenamiento de una respuesta de hipersensibilidad ciertos ensayos en tabaco sugieren que esas elicitinas se unen a receptores de membrana que inducen esta respuesta (43).

PcF y proteínas relacionadas

Ésta es una proteína secretada en P. cactorum que genera necrosis en tomate y fresa. Esta proteína activa una enzima de defensa en la planta (42). Existen otras familias de genes similares a PcF como SCR74 y SCR91 que presentan un alto polimorfismo y que son altamente inducidas durante la infección (29).

Familia tipo NEP1

Esta familia está ampliamente distribuida en patógenos y es altamente conservada entre éstos. Ésta presenta actividad inductora de muerte celular y necrosis en la planta. En el caso de Phytophtora, induce respuesta de defensa tanto en variedades de plantas susceptibles como resistentes en la fase necrótrofa y podría por tanto facilitar la colonización de la planta (29; 46).

"Transglutaminasa GP42 (PEP13)"

En P. sojae se encuentran glicoproteínas como GP42 que al unirse a receptores de membrana de la planta generan una respuesta inmune incluyendo la síntesis de fitoalexinas y muerte celular (40; 50). Estudios bioquímicos de GP42 indican que esta proteína es una transglutaminasa dependiente de calcio (10).

Efectores citoplasmáticos

Éstos son transportados al interior de las células de la planta por medio de vesículas y haustorios (invaginaciones que invaden los tejidos de la planta).

Efectores RXLR

En organismos como el tizón tardío (Phytophthora infestans), oomiceto que ataca la papa (Solanum tuberosum), la mayoría de efectores reportados presentan el dominio RXLR. Estos efectores son secretados y transportados al interior de las células de las planta (9). Además, se encuentran en regiones del genoma de oomicetos ricas en repeticiones (51).

Estructuralmente se caracteriza por poseer un dominio con aminoácidos RXLR en su extremo C-terminal (7).

Dentro de los efectores RXLR se encuentran ciertas proteínas de avirulecia ‘AVr’ que pueden ser detectadas por proteínas de resistencia (R) en la papa, (cuando una proteína del patógeno puede ser detectada por la planta, se genera una repuesta inmune por parte de la planta, lo que se conoce como avirulencia). Este es el caso de AVR3a, una proteína que induce muerte celular y que puede ser reconocida por una proteína de resistencia en la papa, R3a, desencadenando una respuesta de hipersensibilidad en la planta (51).

Efectores Crinkler (CRN)

Estos efectores también se encuentran en P. Infestans en regiones del genoma ricas en repeticiones. Estructuralmente se caracterizan por un dominio LFLAK N- terminal de aproximadamente 50 aminoácidos con funciones similares de secreción e introducción dentro de las células como es el caso del motivo RXLR. Son efectores que producen muerte celular en papa y aunque son pocos los inducidos en la fase e infección sus niveles de expresión en estos pocos son muy altos (51).

Efectores en oomycetes biótrofos

Efectores en oomycetes biotrofos obligados. Este grupo corresponde a aquellos microorganismos capaces de generar enfermedades devastantes en hospederos susceptibles estableciendo una relación dinámica con las células vivas de la planta a través del cual manipulan el metabolismo celular del hospedero para soportar su crecimiento y reproducción (51).

Similar a los genes Avr de los hongos, los oomycetes codifican pequeñas proteínas que son secretadas al medio extracelular de las células del hospedero conocidas como efectores. Dentro de este grupo los organismos más reconocidos corresponden a Hyaloperonospora arabidopsidis y Albugo candida.

• Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa).

Este patógeno es un biotrofo obligado, el cual es capaz de generar infección en hospederos como Arabidopsis thaliana (32; 54). Hpa corresponde al grupo de patógenos conocidos como “mildeos vellosos”, el cual comprende alrededor de 800 especies que causan enfermedades a cientos de especies de plantas (11). Junto con P. infestans, P. ramorum, P. sojae, y P. capsici, Hpa se encuentra secuenciado (y http://phytophthora.vbi.vt.edu phytophthora.vbi.vt.edu) incrementando el interés que se tiene acerca de este organismo.

La secuenciación del genoma de Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa) reveló la presencia de aproximadamente 134 a 140 efectores candidatos para este organismo (HaRxLs), involucrados en supresión de la inmunidad en Arabidopsis (4).

Hasta el momento los análisis genéticos de los efectores involucrados en el proceso de infección han sido difíciles por la incapacidad de cultivar estos organismos in vitro lo que ha dificultado la caracterización funcional de estos efectores.

Hasta el momento se reconocen los efectores ATR1 y ATR13 para este patógeno. El efector ART13 ha sido clonado mostrando altos niveles de polimorfismos. ATR13 codifica 187 aminoácidos que no son homólogas a otras proteínas conocidas y se encuentra formado por una serie de dominios que involucra una secuencia péptidos señal N-terminal, un motivo RxLR asociado en el transporte de las proteínas al interior de las células de la planta, 4 repeticiones de 11 aminoácidos altamente conservados y por último presenta un dominio C-terminal. La variación encontrada en el efector ATR13 involucra tanto la secuencia de aminoácidos y el número de repeticiones de los aminoácidos.

Adicionalmente la variación y polimorfismos encontrados en ATR13 muestran que el efector se encuentra bajo procesos de selección diversificadora durante la co-evolución del patosistema H. parasitica –Arabidopsis (2). Adicionalmente Fabro et al., 2011 evaluaron el rol de 64 efectores en la supresión de PTI y/o ETI. Los resultados obtenidos a partir de ensayos con Pst DC3000 (Pst-LUX) muestran que la mayoría de HaRxLs candidatos incrementan la susceptibilidad de diferentes accesiones de Arabidopsis al patógeno.

Otros efectores identificados en Hpa corresponde a ATR5 identificados usando cruces genéticos entre cepas del patógeno virulentas y no virulentas (3).

• Mecanismos de acción de los efectores detectados en Hpa.

Los estudios realizados por Sohn et al., 2007 utilizando ensayos de inoculación de Accesiones de Arabidopsis mediante el sistema heterólogo por Pst DC3000 T3SS muestran que tanto ATR1 como ATR13 suprime PTI en el hospedero durante una interacción compatible y puede dirigir ETI en accesiones de Arabidopsis resistentes.

El efector ATR13 es reconocido en Arabidopsis thaliana por el gen de resistencia (RPP13), una proteína NBS-LRR de la clase coiled-coil 1 (2). El reconocimiento de este efector conduce a la inducción de vías de defensa y la producción de HR.

Allen et al., 2004 encontró a través de ensayos de expresión transitoria en Arabidopsis que RPP13 reconoce el efector ATR13 de las cepas Emco5, Maks9, Aswa1 y Goco1, pero no reconoce el efector en las cepas Emoy2 y Hind4 de H. parasitica.

Los estudios realizados por Sohn et al., 2007 muestran que el efector ATR13 se encuentra involucrado en la supresión de depósitos de calosa en las paredes celulares de Arabidopsis, esto es similar a lo que se ha reportado en HopM1 para Pst, aunque su función puede ser similar se ha reconocido que estos dos últimos tienen distintos modos de acción en Arabidopsis.

Adicionalmente Shohn et al., 2007 reporta para el caso de ATR13Maks9 una disminución en la producción de ROS, lo que sugiere que diferentes alelos de ATR13 pueden estar involucrados en la supresión de los pasos iniciales involucrados en PTI, estos pueden estar involucrados en mecanismos de supresión asociados a ROS en plantas susceptibles. Estudios adicionales muestran que ATR 13 juega un rol importante en la supresión de PTI activado por efectores de oomycetos similares a Nep-1 y CBEL L (20; 45).

El oomycete Albugo candida es un parásito obligado, causante de la enfermedad conocida como roya blanca que afecta muchas plantas, en este caso las pertenecientes a la familia de las crucíferas, a las que causan enfermedades de una gran importancia económica (13; 60). La secuenciación de A. candida a partir de tejidos de hojas infectadas permitió identificar 15,824 genes predichos, muchos de estos genes carecen de similitud con secuencias de otros oomycetes, y al parecer tiene muy poco repertorio de genes relacionados con patogenicidad en otros oomycetes obligados como H. arabidopsidis incluyendo genes que codifican proteínas efectoras tipo RxLR, genes similares a CRINKLER y elicitinas.

Recientemente identificaron a partir del secretoma de Albugo candida un total de 929 proteínas. Adicionalmente se ha encontrado que A. candida contiene un pequeño grupo de genes que codifican para proteínas secretadas con algún motivo RXLR (Ac-RXL), no obstante los resultados obtenidos soportan un origen independiente de los efectores de A. Candida involucrados en la evolución de la biotrofía.